CATATAN KULIAH PRAKTIKUM DNA

Types of DNA:
Genomic (chromosomal)
Organella (satellite)
Plasmid (extr chromosomal)
Phage/ viral (DS atau SS)
Complementary (mRNA)


Spot: kurang dari 200 ml
Kit Qiagen: lebih sensitif
Beberapa Kit tidak ada proteinase K


Sensitivitas kit lebih rendah --> minimal penggunaan darah 300 mikroliter


Mekanisme:
Merusak membran nukleus




Ekstraksi:
1. Isolasi DNA dari sampel
2. Eliminasi dari debris seluler.
3. Elusi dari DNA yang dimurnikan.


Melepas protein histon: menggunakan…..


Mengukur kemurnian: menggunakan spektrofotometri 1 ml - 2 ml --> tidak bisa karena …
Menggunakan spektrofotometer dengan


General steps:
Step 1: denaturing cell lysis (SDS, alkali, boiling, chaotropic--> melepas ikatan polimer).
Step 2: enzyme treatments
Protease: inaktivasi protein dan inktivasi nuklease --> mengaktivasi DNAse dalm sampel --> karena DNAse menghancurkan DNA yang ada.
RNAse --> DNAse free --> menghilangkan RNA
DNAse --> RNAse free
Step 3: ethanol presipitasi --> ethanol dingin --> kelihatan benang DNA (putih) --> bisa melihat kemurnian, namun mungkin masih bercampur dengan protein --> untuk mengendapkn DNA.




Type of methods:
Differential


Adsoprtion methods (standar yang dipakai sekarang).


Prinsip dari ekstraksi  I:
4. Cell disruption or cell lysis by sonicating, grinding, lysis buffer (Tris HCl, trition X - 100), removal of mebrane lipis by detergents.
5. Tambhkan chelating agents to sequester divalent cations such s Mg2+ and Ca2 to prevents enzymes like DNAse from degrading the DNA.
6. Inkativasi dari nuklease dengan protease K (1 jam atau overnight).. Cellular and histone proteins bound to DNA --> removing


Prinsip ekstrksi II:
Guanidin tiosianat: bagus untuk isolasi DNA tapi karsinogenik --> bisa memisahkn DNA dan protein --> memecah ikatan polimer --> DNA dalam fase (atas) --> fase bawah (protein).
Nucleic acid (DNA, RNA) --> solved in aquaeous phase.
DNA atau RNA kemudian dipresipitasi dengan 2 - propanolol dan etanol.


Prinsip dari ekstraksi 3: spin column based nucleic acid purification (standard method) --> menggunakan silic
DNA melekat pd silica dalam PH tertentu dan buffer asam tertentu.


Ikatan DNA tercampur dengan … --> dicuci dengan bahan tertentu: asam tinggi pH tertentu, nantinya DNA akan tersarinf pada silica..
Pada qiagen menggunkan guanidine.


Kolom dicuci dengan KPO4 pH 8 --> bersifat garam turun --> DNA akan lepas, ikatan turun..


Tahap terakhir --> elution buffer --> jangan dibuang -->


Prinsip chotropic salts --> … DNA mudah berikatan dengan ..


Elusi dengan low salt solution --> allows renaturing of RNA..




Prinsip:
Melisisikan, menghancurkan membran sel..
Proteinase K - destroys ..


Cell soup is added to a spin column,
Filter in the column attracts DNA.


DNA yng terjebak dalam membran silica terjebak --> …


Kesalahan yang sering terjadi:
1. Tidak melabel tube.
2. Proses jangan terlalu lama.
3. Tidak atau lupa mengganti pipet dan macerators.


Pada praktikum DNA yang diisolasi dalam praktikum ini: DNA manusia dan parasit (plasmodium).


Evaluasi asam nukleat:


Spektrofotometer : quantity, quality
Menggunakan panjang gelombang tertentu: 250 - 280 nm
DNA: dites dulu kuantitas dan kualitasnya.

LAPORAN PRAKTIKUM WORKSHOP WESTERN BLOT

LAPORAN PRAKTIKUM WORKSHOP

S2 FASTTRACK BIOMEDIK

WESTERN BLOT

PENDAHULUAN

            Western blot mengidentifikasi antibodi spesifik pada protein yang telah dipishkan antara satu dengan yang lain menurut ukuran nya lewat elektroforesis gel. Blot merupakan sebuah membran, biasanya berbahan dasar nitroselulose atau PVDF (Polyvynilidine fluoride). Gel diletakkan di pada membran dan adanya aliran listrik menginduksi protein pada gel untuk berpindah pada membran yang dilekatkan. Membran tersebut kemudian merupakan replika dari pola protein pada gel yang kemudian diwarnai secar sekuensial dengan antibodi. Prosedur western blot terdiri dari preparasi sampel, elektroforesis gel, transfer dari gel ke membran, dan imunostain dari blot tersebut.

            Western blot dikenal sebagai teknik yang sangat baik dan digunakan secara luas untuk mengidentifikasi dan mengkuantifikasi protein yang spesifik dalam campuran yang kompleks. Teknik ini memungkinkan deteksi tidak langsung atau indirek dari sampel protein yang diimobilisasi pada nitroselulose atau membran PVDF. Pada western blot yang konvensional, sampel protein terlebih dahulu di running dengan SDS – PAGE dan secara elektroforesis ditransfer ke membran. Setelah langkah blocking, membran di probe dengan antibodi primer baik monoclonal maupun poliklonal yang jumlahnya meningkat dibanding antigen. Setelah pencucian yang sekuensial, membran kemudian diinkubasi dengan antibody sekunder yang dikonjugasi dengan enzim yang sifatnya reaktif terhadap antibodi. Aktivitas dari enzim seperti alkaline phospatase (AP) dan horseradish peroxidase (HRP) yang penting untuk pengeluaran sinyal. Pada akhirnya, membran dicuci kembali dengan substrat dari enzim yang tepat yang akan memproduksi sinyal  yang dapat direkam.

            Western blotting merupakan teknik yang digunakan untuk mengidentifikasi dan memposisikan protein berdasarkan kemampuannya untuk berikatan dengan antibody yang spesifik. Analisis western blot dapat mendeteksi protein yang diinginkan dari campuran dari protein dalam jumlah besar. Western blot dapat memberikan informasi tentang ukuran dari protein (dengan perbandingan dengan ukuran marker dalam satuan kilodalton dan juga memberi informasi tentang ekspresi protein (dengan perbandingan dengan kontrol seperti pada sampel yang tidak diberi perlakuan atau sel atau jaringan tipe lain).

            Sebagai rangkuman, western blot memberi informasit tentang ukuran dari protein dan jumlah ekspresi protein. Analisis western blot dapat menganalisis sampel protein dari sel atau jaringan, namun juga dapat menganalisa protein rekombinan yang disintesis secara in vitro.

TUJUAN

Mengetahui adanya antigen dalam suatu sampel protein dengan melihat adanya reaksi antigen – antibody pada membran hasil transfer dari gel SDS – PAGE.

METODE

Alat dan Bahan

Alat

·         Inkubator

·         Kertas

·         Shaker

Bahan

·         Kertas saring

·         Membrane NC

·         Gel SDS – PAGE

·         Tris Base Solution (TBS)

-       Tris Base 50 mM : 6,06 gram

-       NaCl 0,2M : 11,68 gram

-       Dd H₂O : 1000 ml adjust pH 7,4

·         Transfer buffer

-       Tris Base 25mM : 3,03 gram

-       Glycine 192 mM : 14,4 gram

-       Methanol 20% : 200 ml

-       Dd H₂O ditambahkan hingga 1000 ml

Metode Uji Titer Spesifisitas Anti – Antibodi dengan Teknik Western Blot

1.    Rendam membrane blotting dan gel elektroforesis SDS-PAGE masing – masing dalam transfer buffer 30 menit (dishaker).

2.    Setting alat : trans-blot semi Dry Merk. Bio rad. Susun sandwich (urutan dari bawah ke atas) :

·         Kertas saring

·         Membrane NC

·         Gel SDS-PAGE

·         Kertas saring

Running pada 300MA, 20 Volt selama 2 jam untuk proses transfer

3.    Angkat NC dan cuci dengan akuades, rendam dalam ponceau selama 1 menit, dan bilas aquades untuk konfirmasi keberhasilan. Transfer pita protein dari gel SDS-PAGE ke membrane NC. Bloking dengan TBS-SKIM milk 5% inkubasi overnight 4^oC.

4.    Keluarkan sampai suhu ruang tercapai, dishaker.

5.    Cuci NC dengan TBS-tween 0,05% 2 x 10 menit, shake pelan.

6.    Inkubasi dengan Antibiotik primer yang dilarutkan dalam TBS-Skim Milk 1% selama 2 jam pada suhu ruang.

7.    Cuci NC dengan TBS-tween 0,05% 2 x 10 menit, shaker pelan.

8.    Inkubas dengan antibiotic sekunder-berlabel yang dilarutkan dalam TBS selama 1 jam pada suhu ruang.

9.    Cuci NC dengan TBS tween 0,05% 1x10 menit, shaker pelan.

10.  Inkubasi dengan substrat ( Wentern blue untuk AP conjugate; TMB untuk biotin) sampai muncul pita protein.

11.  Stop reaksi dengan dd H₂O, kering anginkan membrane NC, kemudian scan hasilnya

HASIL

DOKUMENTASI PENELITIAN

Setelah membran di staining, terlihat gambaran Band Protein yang Terdapat Pada Membran Nitroselulosa

10 kDa

17 kDa

26 kDa

34 kDa

42 kDa

52 kDa

72 kDa

95 kDa

135 kDa

260 kDa

90 kDa

86 kDa

96 kDa

125 kDa

21 kDa

26 kDa

21 kDa

26 kDa

Sumuran	Sampel
1	Marker
2	Kosong
3	Pili H. pylori
4	Kosong
5	Pili Shigella
6	Kosong
7	OMP Shigella

Penentuan Berat Molekul Protein dengan Analis Regresi Linier

Protein Marker

Band	Berat Molekul	Tracking Distance	LOG BM	Refractory Factor
1	260	5	2.414973	0.075758
2	135	8	2.130334	0.121212
3	95	10	1.977724	0.151515
4	72	12.5	1.857332	0.189394
5	52	18	1.716003	0.272727
6	42	22.5	1.623249	0.340909
7	34	27	1.531479	0.409091
8	26	33	1.414973	0.5
9	17	43.5	1.230449	0.659091
10	10	60	1	0.909091

Dari kurva marker Log BM (x) dan RF (y) didapatkan rumus:

y = -0.593x + 1.365
R² = 0.905, di mana R² yang baik lebih dari 0,98

Jadi untuk menghitung berat molekul protein sampel:
Log BM = (RF – 1,365)/ -0,593

BM = 10^{(Log BM)}

Sample 2 Pilli Shigella

Tracking Distance	RF	LOG BM	BM
8	0.121212	2.09745	125.1555
12.5	0.189394	1.982472	96.04445
13.5	0.204545	1.956922	90.55692
14.25	0.215909	1.937759	86.64803
34.5	0.522727	1.420359	26.32442
38.5	0.583333	1.318156	20.80445

Sample 3 OMP Shigella

Tracking Distance	RF	LOG BM	BM
34.5	0.522727	1.420359	26.32442
38.5	0.583333	1.318156	20.80445

DISKUSI

            Pada western blot, band yang terlihat pada membran nitroselulose merupakan band protein yang berikatan dengan antibody yang diberikan. Pada penelitian ini sampel gel yang telah ditransfer ke membran, diberikan antibodi protein 49 kDa pada 3 sampel yaitu H. pylori, pili shigella, dan OMP shigella, kemudian dilihat apakah terdapat reaksi silang antara sampel protein dengan antibodi yang diberikan pada 3 sampel tersebut.

            Hasil dari penelitian menunjukkan tidak adanya reaksi antara antibodi protein 49 kDa Shigella dengan pili H. pylori, sedangkan antibodi protein 49 kDa Shigella dapat bereaksi dengan protein 20,8 kDa, 26,3 kDa, dan 86,6 kDa, 90,6 kDa, 96 kD, dan 125,2 kDa dari pili Shigella. Antibodi protein 49 kDa Shigella juga dapat beraksi dengan protein 20,8 kDa dan 26,3 kDa daari OMP Shigella.