CATATAN KULIAH METODOLOGI

Observation to gain data
Validity nd reability


Data seharusnya diambil dari subjek penelitian
Dat primer dimbil langsung
Data sekunder dimbil pihak lain.


PICO
P: patient, problem
Subjek yang diambil, diukur: datanya/ variabel/ ciri/ sifat.
Variabel harus bisa diukur
Harus ada variasi
Diambil dengan alat ukur


Alat ukur: timbangan, penggaris, disebut instrumen --> penelitian kuantitatif --> diukur --> hasil berupa data -->


Untuk penelitian kuantitatif --> angka
Ukuran kualitatif:


Karena alat ukur orng --> subjektif -->
Triangulasi: Wawncara, observasi di lapangan, melihat status


Contoh kualitatif: apa adanya


Bunyi: …dB, berapa kali pukulan
Kualittif: terdengar tidak terdengar, makna --> pagi hari --> bel sekolahan --> berupa kata - kata bermakna --> siang di gereja --> mulai berdoa --> yang penting makna


Makna --> sesuatu yang penting --> yang penting makna




VARIABEL
Ciri - ciri atau sifat suatu obyek
Konsep abstrak yang dapat diukur
Tidak seuanya dapat diukur langsung


Diukur: variabel manifest = indikator --> tinggi badan, jumlah sel,
Konsep abstrak yang langsung dapat diukur




Variabel laten = konstruk:
Tidak dapat diukur secara langsung
Contoh: kepuasan kerja, kekayaan: pendapatan, mobil, rumah


Pengukuran: memaksakan suatu angka secara sistematik sebagai cra menyajikan ciri - ciri arau sifat suatu subjek (variabel) --> validitas/ realibilitas instrumen


Validitas: ada dua:
Pengukuran dan penelitian:
 
Yang dimaksud adalah validitas pengukuran
Pengukuran yng valid:
Alat yang digunakan sesuai dengan yang diukur, mengukur benar - benr apa yang akan diukur
Mengukur kuman typhoid tapi faktor lain tidak terukur --< tidak valid --> harus tepat.
Tepat:


Reliable: konsisten, misal beratnya tetap.


Instrumen yang tidak konsisten:
Penggaris dan.
Akurat --> panjang asli 10 hasilnya sama 10


Teliti berbicara tentang slhny
Akurat berbicara tentang benarnya.


Skala data
Hasil bisa nominal, misal jenis kelamin: laki perempuan --> nominal --> ada bedanya
Ordinal: ada beda dan tingkatan
Interval: ada beda tingkatan dan interval --> interval: misal suhu 10,20
Rasio: misal berat 5 dan 10: ada beda ada tingkatan, ada interval, adaaa) mempunyai arti.
Ada 0 yang punya arti misal temperatur atau suhu 0


Nominal/ ordinal = data kualitatif = data kategorik
Interval/rasio = data kuantitatif = numerik = scale
Penelitian sosial: likert = data kuantitatif --> ada 5


Kalau 4 ordinal


Pendidikan: SMA/ bukan SMA: nominal
< = SMA, perguruan tinggi: ordinal
SD, SMP, SMA, PT: ordinal: karena ada 4
SD, SMP, SMA, S1, Pasca --> likert: ada 5


Kualitatif: kategorik


Gaji: rendah (<1juta), Tinggi,..
<500, 500 - 1000, > 1000:  ordinal
100.000 - … --> ada 0 nya --> likert


Tekanan darah: terkontrol/ tidak terkontrol
Terkontrol: TD 2 kali pengukuran selama 2 bulan berturut turut terdapat TD 120 - 139/ 80 - 89
Termasuk kategori ordinal
Tidak terkontrol


Konsumsi garam: terkontrol/ tidak terkontrol
Konsumsi garam terkontrol (<= 6 gram per hri) --> ordinal


Sindroma nefrotik:
Resisten steroid
Sensitif steroid
Seharusnya ini adalah ukuran --> variabelnya sensitifitas


Ibu peserta KB suntik 3 bulanan
Ibu peserta KB suntik 1 bulanan


Kontrol:


Interval: jika ada kelipatan


How to choose statistic method:
1. skala data:
Nominal = kategorik
Ordinal = kategorik
Kuantitatif = numerik = scale : interval, rasio


2. Data berpasangan = sama subjek = related
Tidak berpasangan =


Tabulasi data untuk uji statistik

Sampel nomor	sex	TB		Gaji	Obat A	Status Kesehatan



Hasil harus diukur -> memaksakan suatu angka


Berpasangn = sama subjek= related
Tidak berpasangan/ independent kelompok data


Manipulasi data: merubah - rubah, data yang dirubah --> ada informasi yang hilang





Skala data	Bentuk hipotesis
	Satu variabel (deskripsi)	Komparatif (2 variabel)













Uji: komparatif --> korelatif
Komparatif: tidak berpasangan berpasangan




1. Apakah terdapat perbedeaan rerata Body Mass Index (skal pengukuran numerik) antara kelompok status ekonomi tinggi dan kelompok ekonomi rendah?


Yang dibandingkan: data numerik: uji beda, 2 kelompok, uji yang dipakai: uji T tidak berpasangan


2. Apakah terdapat perbedaan rerata kadar kolesterol (skala pengukurn numerik) sebelum dan sesudh


Data numerik, berpasangan, 2 kelompok


3.  
Uji komparatif, lebih dari 2, tidak berpasangan: uji oneway anova


4. Apakah terdapat perbedaan rerata kadar kolesterol
Berpasangan uji komparatif, lebih dari 2 kelompok: repeated.


5. Apakah terdapat hubungan antara perilaku merokok (merokok dan tidak merokok) dengan infertilitas pria (fertil dan infertil)
Nominal dan nominal, uji …


6. Apakah terdapat hubungan antara perilaku merokok ibu (merokok dan tidak merokok) dengan preeklamsia (terjadi preeklmsia dan tidak terjadi preeklamsia).


7. Apakah


Nomor terakhir
Apakh ada korelasi antara kadar gula (skala pengukuran numerik) dengan kadar kolesterol


Menentukan uji: dasarnya masalah dan pertanyaan


Apakah penggunaan ekstrak X dapat menurunkan parasitemia pada mencit


Uji:


Tabel: mendatar: berpasangan: komparatif
Menurun: tidak berpasangan: korelatif


Mengetahui dan memahami sebab akibat


Causal relationship:
Therapy:
Treatment: improvement in patient's condition.
Etiology:
Causal factor: decrese incidence.


Definition of causation


Fixed mss of gas at fixed temperature
Pressure >> --> volume <<


Metal br
Temperature >> --> length >>


Causation in health:
Infection w/ m.tbc --> clinical tubericulosis.


Fisika --> kimia --> biologi -->


Fctor --> is  cause of an event if its operation increases the frequency of the event.


Jika meningkatkan variabel tergantung


Membandingkan jika ada peningkatan atau perubahn
Yang dilihat: variabel kontrol.


Sebab - akibat: apakah ekstrak dapat mencegah parasitemia


Tidak diberi ekstrak dan diberi ekstrak: kontrol negatif


Chance variation:


Validitas penelitian:
Internal: ada causal relationship: PICO
Non causal relationship: confounding, bias, chance


Eksternal:
Sampel: generalisasi
Sampel: mewakili populasi
Agar mewakili populasi: sampel harus sama… banyak cara
Random, jumlah harus memakai rumus.


Kemungkinan mati --> sampel sesuai tujuan ditambah kemungkinan mati


Berdasarkan onset of action: 4 hari --> tetapi tetap ….. --> tidak etis.


Korelasi kalau ada sebab akibat


Ada 2 hal dengan penyebab sama pasti ada korelasi


Hipotesis:
Subyek --> 1 variabel --> deskriptif
Subyek --> 2 variabel X --> Y --> bivariat, sederhana, beda/ korelasi
Subyek --> 3 variabel


Pola hubungan antar variabel:


0,5 + 0,33 + 0,41 x


Outer model = measurement model--> loading factor
Inner model = hubungn sebab akibat, prediksi


SEM:
 
Variabel manifest: kotak

CATATAN KULIAH PRAKTIKUM RADIKAL BEBAS

1:23 PM

MDA stndard: meliihat sesuatu dengan spektrofotometer: menentukan panjang gelombng maksimal dari MDA standard: misa; 532 nm.. --> menentukan lebih dulu karena setiap alat berbeda.

Pemeriksaan malondialdehid

Menggunatakn thiobarbiturate acid (TBA) pada suasana asam (pH 2 - 3) dan temperatur 97 - 100o C. memberikan warna pink.

Penentuabn panjang gelombng maksimal: didapatkan 531,6 nm;

Pembuatan kurv baku --> karena yang dilihat adalah absrobsi, dibuat grafika antara konsentrsi dan absorbsi.

Membuat kurva kerja tidak boleh kecil --> klo kecil membut kerja ulang; hukum lambnag --> yang lurus 20 - 30 persen.

Penetun kadar MDA sampel:

Menggunakan TCA 40% --> serum --> protein nya besar --> TCA banyak; tulang --> TCA sedikit.

SOD Lebih banyak --> superoxide tinggal sedikit --> lifetime pendek --> diberikan staining

NGT

CATATAN KULIAH PRAKTIKUM DNA

Types of DNA:
Genomic (chromosomal)
Organella (satellite)
Plasmid (extr chromosomal)
Phage/ viral (DS atau SS)
Complementary (mRNA)


Spot: kurang dari 200 ml
Kit Qiagen: lebih sensitif
Beberapa Kit tidak ada proteinase K


Sensitivitas kit lebih rendah --> minimal penggunaan darah 300 mikroliter


Mekanisme:
Merusak membran nukleus




Ekstraksi:
1. Isolasi DNA dari sampel
2. Eliminasi dari debris seluler.
3. Elusi dari DNA yang dimurnikan.


Melepas protein histon: menggunakan…..


Mengukur kemurnian: menggunakan spektrofotometri 1 ml - 2 ml --> tidak bisa karena …
Menggunakan spektrofotometer dengan


General steps:
Step 1: denaturing cell lysis (SDS, alkali, boiling, chaotropic--> melepas ikatan polimer).
Step 2: enzyme treatments
Protease: inaktivasi protein dan inktivasi nuklease --> mengaktivasi DNAse dalm sampel --> karena DNAse menghancurkan DNA yang ada.
RNAse --> DNAse free --> menghilangkan RNA
DNAse --> RNAse free
Step 3: ethanol presipitasi --> ethanol dingin --> kelihatan benang DNA (putih) --> bisa melihat kemurnian, namun mungkin masih bercampur dengan protein --> untuk mengendapkn DNA.




Type of methods:
Differential


Adsoprtion methods (standar yang dipakai sekarang).


Prinsip dari ekstraksi  I:
4. Cell disruption or cell lysis by sonicating, grinding, lysis buffer (Tris HCl, trition X - 100), removal of mebrane lipis by detergents.
5. Tambhkan chelating agents to sequester divalent cations such s Mg2+ and Ca2 to prevents enzymes like DNAse from degrading the DNA.
6. Inkativasi dari nuklease dengan protease K (1 jam atau overnight).. Cellular and histone proteins bound to DNA --> removing


Prinsip ekstrksi II:
Guanidin tiosianat: bagus untuk isolasi DNA tapi karsinogenik --> bisa memisahkn DNA dan protein --> memecah ikatan polimer --> DNA dalam fase (atas) --> fase bawah (protein).
Nucleic acid (DNA, RNA) --> solved in aquaeous phase.
DNA atau RNA kemudian dipresipitasi dengan 2 - propanolol dan etanol.


Prinsip dari ekstraksi 3: spin column based nucleic acid purification (standard method) --> menggunakan silic
DNA melekat pd silica dalam PH tertentu dan buffer asam tertentu.


Ikatan DNA tercampur dengan … --> dicuci dengan bahan tertentu: asam tinggi pH tertentu, nantinya DNA akan tersarinf pada silica..
Pada qiagen menggunkan guanidine.


Kolom dicuci dengan KPO4 pH 8 --> bersifat garam turun --> DNA akan lepas, ikatan turun..


Tahap terakhir --> elution buffer --> jangan dibuang -->


Prinsip chotropic salts --> … DNA mudah berikatan dengan ..


Elusi dengan low salt solution --> allows renaturing of RNA..




Prinsip:
Melisisikan, menghancurkan membran sel..
Proteinase K - destroys ..


Cell soup is added to a spin column,
Filter in the column attracts DNA.


DNA yng terjebak dalam membran silica terjebak --> …


Kesalahan yang sering terjadi:
1. Tidak melabel tube.
2. Proses jangan terlalu lama.
3. Tidak atau lupa mengganti pipet dan macerators.


Pada praktikum DNA yang diisolasi dalam praktikum ini: DNA manusia dan parasit (plasmodium).


Evaluasi asam nukleat:


Spektrofotometer : quantity, quality
Menggunakan panjang gelombang tertentu: 250 - 280 nm
DNA: dites dulu kuantitas dan kualitasnya.

ABSTRAK TA

ABSTRAK

Efek Ekstrak Alga Coklat (Sargassum sp.) terhadap Densitas Protein Caspase 9 pada Kultur Sel HeLa

(Suatu Pengamatan dengan Menggunakan Metode Pewarnaan Imunositokimia)

dr. Pudjo Sanjoto, M.Kes*, Dr. dr. Nurdiana Z., M.Kes**, I Putu Juniartha***

Latar Belakang: Kanker serviks merupakan penyebab utama kematian utama pada wanita di Negara berkembang. Sel HeLa merupakan continuous cell line dari sel serviks yang menjadi ganas akibat infeksi HPV 18. Alga coklat Sargassum sp. diketahui memiliki pigmen utama dari golongan karotenoid yaitu fucoxanthine. Fucoxanthine diketahui dapat menyebabkan hilangnya potensial membran dari mitokondria dan memicu pengeluaran Sitokrom – C untuk mengaktifkan Caspase 9 dan menginisiasi cascade caspase. Tujuan: Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek ekstrak alga coklat. terhadap densitas protein Caspase 9. Metode: Desain penelitian ini adalah true experimental in vitro. Terdapat 4 kelompok perlakuan dengan 5 kali pengulangan (n=5), yaitu kelompok kontrol dan kelompok perlakuan 1, 2, dan 3 yang diberi 3 konsentrasi ekstrak yang berbeda (31,25 µg/ml, 62,5 µg/ml, dan 125 µg/ml). Setelah itu dilakukan pengecatan imunositokimia untuk mengamati densitas protein Caspase 9. Hasil: Terdapat peningkatan densitas protein Caspase 9 pada kelompok perlakuan dibandingkan kelompok kontrol. Peningkatan densitas paling tinggi terdapat pada kelompok perlakuan 3 (konsentrasi 125 µg/ml). Terlihat peningkatan apoptotic bodies terbanyak pada kelompok perlakuan 3 (konsentrasi 125 µg/ml). Analisis hasil penelitian menggunakan Oneway ANOVA menunjukkan perbedaan yang signifikan antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan pada 0,000 (α<0,05) dan dengan uji regresi didapatkan koefisien korelasi sebesar 0,975 (R = 0,975). Kesimpulan: Ekstrak alga coklat Sargassum sp. dapat meningkatkan densitas protein Caspase 9 pada  kultur sel HeLa dan konsentrasi 125 µg/ml memberikan peningkatan densitas paling tinggi.

Kata Kunci: Kanker serviks, sel HeLa, ekstrak alga coklat Sargassum sp., fucoxanthine, caspase 9, densitas, apoptotic bodies.

ABSTRACT

The Role of Brown Algae (Sargassum sp.) Extract to Caspase 9 Densities in HeLa Cell Line Culture

(An Observation with Immunocytochemistry Staining Method)

Background: Cervix cancer is the main cause of cancer occurred in women of developing countries. HeLa cell line is a continuous cell line from cervix cells that become wild because it has been infected by HPV 18. Brown algae Sargassum sp. known to have main pigment from carotenoid groups, that is fucoxanthine. Fucoxanthine known to have effect in vanishing mitochondria potential membrane and triggers cytochrome C release to activate Caspase 9 and initiate caspase cascade. Objective: This research aimed to know the effect of brown algae Sargassum sp. extract to Caspase 9 protein density. Method: This research design is true experimental in vitro. There is 4 treatment groups with 5 repetition (n = 5), that is control group and treatment group 1, 2, and 3, that given brown algae extract with 3 different concentrations (31,25 µg/ml, 62,5 µg/ml, and 125 µg/ml). After the treatment given, immunocytochemistry staining was done to observe the Caspase 9 protein density. Result: There is an increasing level of Caspase 9 protein in treatment groups compared to control group. The density is mostly increased at 3^rd treatment group (125 µg/ml concentration). The apoptotic bodies also mostly increased at 3^rd treatment group (125 µg/ml concentration). Research results was analyzed with Oneway ANOVA and shows there is any significant difference between control group and treatment groups at 0,000 (α<0,05) and Regression test shows the correlation coefficient as much as 0,975 (R = 0,0975). Conclusion: Brown algae Sargassum sp. extract can increase density of Caspase 9 protein in HeLa cell culture and concentration of 125 µg/ml shows most increasing level of density.

Key Words: Cervix Cancer, HeLa Cell Line, Sargassum sp. brown algae extract, fucoxanthine, caspase 9, density, apoptotic bodies.

*           Laboratorium Skill FKUB

**          Laboratorium Farmakologi FKUB

***        Mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter FKUB

CATATAN KULIAH FLOWCYTOMETRY

Flowcytometry

Organ: ekstraksi smpai homogen

• Fetal Calf serum (FCS)
• Fetal bovine serum
• Sel dalam keadaan hidup
• Untuk melihat apoptosis, cell cycle.

Flow cytometry

• Satu dot adalah satu sel
• Metri: diukur secara pasti à kuantitatif
• Bisa menghitung 500 sampai 4000 sel per detik.
• Memisahkan atau mengkarakterisasi single cell.

• 100 sel à 1 jam bisa selesai
• Di setting jumlah sel yang ingin diukur 
• Mengukur berdasarkan granularity dan size
• SSC: berdasarkan size (side scatter cell)
• FSC: berdasarkan granularity (forward scatter cell)
• Membedakan life cell atau dead cell.
• Semua sel hrus dilabel dengan imunofluoresens

Flowcytometry biomedik: hanya bisa melabel 3 antibodi: three color staining dengan 1 laser.

• 3: 1 laser (yang di biomedik)
• 4: ada 2 laser.
• 12: 1 sampel untuk 12 macam marker, ada 4 laser.

Kombinasi dalam grafik:

• CD4 – CD8
• CD 4 – IL – 10

Fluorokrom: label fluoresens: filter berdasarkan label yang dipakai

• FLI – FITC
• FL2 – PE
• FL3 – PerPC

• PE: panjang gelombang 500 sekian.
• Laser bisa membaca berdasarkan panjang gelombang yang kita pakai: range:
• Ficoll: gradient sentrifugation: limfosit, monosit, neutrofil.
• Pada grafik sel semakin kecil semakin ke sebelah kiri.
• Urutan: Kecil menengah besar.
•  Mati: kuadran sebelah kiri atas à Karena sel kecil à mengkerut/ menciut
• Melingkari: membuat region.

• CD3 untuk marker T cell lymphocyte
• B cell : CD 19
• CD 14 marker monosit:

Membuat region dalam flowcytometry:

• Tidak ada batas yang jelas à mix à memilih sel mana yang dimasukkan region
• Ada subyektifitas à butuh pengalaman berulang ulang membaca flowcytometri

• Hanya sel yang berinti yang bias diamati dengan menggunakan flowcytometri.
• Marker yang diekspresikan hanya terdapat pada limfosit
• Jangan lupa ada logbook

Two direct color staining

• Incubate à wash à analyze

Applying gates:

• Sel positif CD3 ke arah atas.
• Bawah: sel  lain selain limfosit Tà yaitu sel limfosit B.

• Di grafik: 10³ atau 10^xxx à log à larinya sel..

• PE: CD4
• FIC: IFN Y

Cell cycle analysis:

• Apoptosis: pake propidium iodide
• BrDu
• CFSE:

Mendeteksi proliferasi sel:

• Presentasi dari sel yang berproliferasi dengan CFSE tereduksi
• Proliferasi sel dalam hasil presentase (banyaknya sel yang proliferasi)

LAPORAN PRAKTIKUM WORKSHOP WESTERN BLOT

LAPORAN PRAKTIKUM WORKSHOP

S2 FASTTRACK BIOMEDIK

WESTERN BLOT

PENDAHULUAN

            Western blot mengidentifikasi antibodi spesifik pada protein yang telah dipishkan antara satu dengan yang lain menurut ukuran nya lewat elektroforesis gel. Blot merupakan sebuah membran, biasanya berbahan dasar nitroselulose atau PVDF (Polyvynilidine fluoride). Gel diletakkan di pada membran dan adanya aliran listrik menginduksi protein pada gel untuk berpindah pada membran yang dilekatkan. Membran tersebut kemudian merupakan replika dari pola protein pada gel yang kemudian diwarnai secar sekuensial dengan antibodi. Prosedur western blot terdiri dari preparasi sampel, elektroforesis gel, transfer dari gel ke membran, dan imunostain dari blot tersebut.

            Western blot dikenal sebagai teknik yang sangat baik dan digunakan secara luas untuk mengidentifikasi dan mengkuantifikasi protein yang spesifik dalam campuran yang kompleks. Teknik ini memungkinkan deteksi tidak langsung atau indirek dari sampel protein yang diimobilisasi pada nitroselulose atau membran PVDF. Pada western blot yang konvensional, sampel protein terlebih dahulu di running dengan SDS – PAGE dan secara elektroforesis ditransfer ke membran. Setelah langkah blocking, membran di probe dengan antibodi primer baik monoclonal maupun poliklonal yang jumlahnya meningkat dibanding antigen. Setelah pencucian yang sekuensial, membran kemudian diinkubasi dengan antibody sekunder yang dikonjugasi dengan enzim yang sifatnya reaktif terhadap antibodi. Aktivitas dari enzim seperti alkaline phospatase (AP) dan horseradish peroxidase (HRP) yang penting untuk pengeluaran sinyal. Pada akhirnya, membran dicuci kembali dengan substrat dari enzim yang tepat yang akan memproduksi sinyal  yang dapat direkam.

            Western blotting merupakan teknik yang digunakan untuk mengidentifikasi dan memposisikan protein berdasarkan kemampuannya untuk berikatan dengan antibody yang spesifik. Analisis western blot dapat mendeteksi protein yang diinginkan dari campuran dari protein dalam jumlah besar. Western blot dapat memberikan informasi tentang ukuran dari protein (dengan perbandingan dengan ukuran marker dalam satuan kilodalton dan juga memberi informasi tentang ekspresi protein (dengan perbandingan dengan kontrol seperti pada sampel yang tidak diberi perlakuan atau sel atau jaringan tipe lain).

            Sebagai rangkuman, western blot memberi informasit tentang ukuran dari protein dan jumlah ekspresi protein. Analisis western blot dapat menganalisis sampel protein dari sel atau jaringan, namun juga dapat menganalisa protein rekombinan yang disintesis secara in vitro.

TUJUAN

Mengetahui adanya antigen dalam suatu sampel protein dengan melihat adanya reaksi antigen – antibody pada membran hasil transfer dari gel SDS – PAGE.

METODE

Alat dan Bahan

Alat

·         Inkubator

·         Kertas

·         Shaker

Bahan

·         Kertas saring

·         Membrane NC

·         Gel SDS – PAGE

·         Tris Base Solution (TBS)

-       Tris Base 50 mM : 6,06 gram

-       NaCl 0,2M : 11,68 gram

-       Dd H₂O : 1000 ml adjust pH 7,4

·         Transfer buffer

-       Tris Base 25mM : 3,03 gram

-       Glycine 192 mM : 14,4 gram

-       Methanol 20% : 200 ml

-       Dd H₂O ditambahkan hingga 1000 ml

Metode Uji Titer Spesifisitas Anti – Antibodi dengan Teknik Western Blot

1.    Rendam membrane blotting dan gel elektroforesis SDS-PAGE masing – masing dalam transfer buffer 30 menit (dishaker).

2.    Setting alat : trans-blot semi Dry Merk. Bio rad. Susun sandwich (urutan dari bawah ke atas) :

·         Kertas saring

·         Membrane NC

·         Gel SDS-PAGE

·         Kertas saring

Running pada 300MA, 20 Volt selama 2 jam untuk proses transfer

3.    Angkat NC dan cuci dengan akuades, rendam dalam ponceau selama 1 menit, dan bilas aquades untuk konfirmasi keberhasilan. Transfer pita protein dari gel SDS-PAGE ke membrane NC. Bloking dengan TBS-SKIM milk 5% inkubasi overnight 4^oC.

4.    Keluarkan sampai suhu ruang tercapai, dishaker.

5.    Cuci NC dengan TBS-tween 0,05% 2 x 10 menit, shake pelan.

6.    Inkubasi dengan Antibiotik primer yang dilarutkan dalam TBS-Skim Milk 1% selama 2 jam pada suhu ruang.

7.    Cuci NC dengan TBS-tween 0,05% 2 x 10 menit, shaker pelan.

8.    Inkubas dengan antibiotic sekunder-berlabel yang dilarutkan dalam TBS selama 1 jam pada suhu ruang.

9.    Cuci NC dengan TBS tween 0,05% 1x10 menit, shaker pelan.

10.  Inkubasi dengan substrat ( Wentern blue untuk AP conjugate; TMB untuk biotin) sampai muncul pita protein.

11.  Stop reaksi dengan dd H₂O, kering anginkan membrane NC, kemudian scan hasilnya

HASIL

DOKUMENTASI PENELITIAN

Setelah membran di staining, terlihat gambaran Band Protein yang Terdapat Pada Membran Nitroselulosa

10 kDa

17 kDa

26 kDa

34 kDa

42 kDa

52 kDa

72 kDa

95 kDa

135 kDa

260 kDa

90 kDa

86 kDa

96 kDa

125 kDa

21 kDa

26 kDa

21 kDa

26 kDa

Sumuran	Sampel
1	Marker
2	Kosong
3	Pili H. pylori
4	Kosong
5	Pili Shigella
6	Kosong
7	OMP Shigella

Penentuan Berat Molekul Protein dengan Analis Regresi Linier

Protein Marker

Band	Berat Molekul	Tracking Distance	LOG BM	Refractory Factor
1	260	5	2.414973	0.075758
2	135	8	2.130334	0.121212
3	95	10	1.977724	0.151515
4	72	12.5	1.857332	0.189394
5	52	18	1.716003	0.272727
6	42	22.5	1.623249	0.340909
7	34	27	1.531479	0.409091
8	26	33	1.414973	0.5
9	17	43.5	1.230449	0.659091
10	10	60	1	0.909091

Dari kurva marker Log BM (x) dan RF (y) didapatkan rumus:

y = -0.593x + 1.365
R² = 0.905, di mana R² yang baik lebih dari 0,98

Jadi untuk menghitung berat molekul protein sampel:
Log BM = (RF – 1,365)/ -0,593

BM = 10^{(Log BM)}

Sample 2 Pilli Shigella

Tracking Distance	RF	LOG BM	BM
8	0.121212	2.09745	125.1555
12.5	0.189394	1.982472	96.04445
13.5	0.204545	1.956922	90.55692
14.25	0.215909	1.937759	86.64803
34.5	0.522727	1.420359	26.32442
38.5	0.583333	1.318156	20.80445

Sample 3 OMP Shigella

Tracking Distance	RF	LOG BM	BM
34.5	0.522727	1.420359	26.32442
38.5	0.583333	1.318156	20.80445

DISKUSI

            Pada western blot, band yang terlihat pada membran nitroselulose merupakan band protein yang berikatan dengan antibody yang diberikan. Pada penelitian ini sampel gel yang telah ditransfer ke membran, diberikan antibodi protein 49 kDa pada 3 sampel yaitu H. pylori, pili shigella, dan OMP shigella, kemudian dilihat apakah terdapat reaksi silang antara sampel protein dengan antibodi yang diberikan pada 3 sampel tersebut.

            Hasil dari penelitian menunjukkan tidak adanya reaksi antara antibodi protein 49 kDa Shigella dengan pili H. pylori, sedangkan antibodi protein 49 kDa Shigella dapat bereaksi dengan protein 20,8 kDa, 26,3 kDa, dan 86,6 kDa, 90,6 kDa, 96 kD, dan 125,2 kDa dari pili Shigella. Antibodi protein 49 kDa Shigella juga dapat beraksi dengan protein 20,8 kDa dan 26,3 kDa daari OMP Shigella.