CATATAN KULIAH FLOWCYTOMETRY

Flowcytometry

Organ: ekstraksi smpai homogen

• Fetal Calf serum (FCS)
• Fetal bovine serum
• Sel dalam keadaan hidup
• Untuk melihat apoptosis, cell cycle.

Flow cytometry

• Satu dot adalah satu sel
• Metri: diukur secara pasti à kuantitatif
• Bisa menghitung 500 sampai 4000 sel per detik.
• Memisahkan atau mengkarakterisasi single cell.

• 100 sel à 1 jam bisa selesai
• Di setting jumlah sel yang ingin diukur 
• Mengukur berdasarkan granularity dan size
• SSC: berdasarkan size (side scatter cell)
• FSC: berdasarkan granularity (forward scatter cell)
• Membedakan life cell atau dead cell.
• Semua sel hrus dilabel dengan imunofluoresens

Flowcytometry biomedik: hanya bisa melabel 3 antibodi: three color staining dengan 1 laser.

• 3: 1 laser (yang di biomedik)
• 4: ada 2 laser.
• 12: 1 sampel untuk 12 macam marker, ada 4 laser.

Kombinasi dalam grafik:

• CD4 – CD8
• CD 4 – IL – 10

Fluorokrom: label fluoresens: filter berdasarkan label yang dipakai

• FLI – FITC
• FL2 – PE
• FL3 – PerPC

• PE: panjang gelombang 500 sekian.
• Laser bisa membaca berdasarkan panjang gelombang yang kita pakai: range:
• Ficoll: gradient sentrifugation: limfosit, monosit, neutrofil.
• Pada grafik sel semakin kecil semakin ke sebelah kiri.
• Urutan: Kecil menengah besar.
•  Mati: kuadran sebelah kiri atas à Karena sel kecil à mengkerut/ menciut
• Melingkari: membuat region.

• CD3 untuk marker T cell lymphocyte
• B cell : CD 19
• CD 14 marker monosit:

Membuat region dalam flowcytometry:

• Tidak ada batas yang jelas à mix à memilih sel mana yang dimasukkan region
• Ada subyektifitas à butuh pengalaman berulang ulang membaca flowcytometri

• Hanya sel yang berinti yang bias diamati dengan menggunakan flowcytometri.
• Marker yang diekspresikan hanya terdapat pada limfosit
• Jangan lupa ada logbook

Two direct color staining

• Incubate à wash à analyze

Applying gates:

• Sel positif CD3 ke arah atas.
• Bawah: sel  lain selain limfosit Tà yaitu sel limfosit B.

• Di grafik: 10³ atau 10^xxx à log à larinya sel..

• PE: CD4
• FIC: IFN Y

Cell cycle analysis:

• Apoptosis: pake propidium iodide
• BrDu
• CFSE:

Mendeteksi proliferasi sel:

• Presentasi dari sel yang berproliferasi dengan CFSE tereduksi
• Proliferasi sel dalam hasil presentase (banyaknya sel yang proliferasi)