LAPORAN PRAKTIKUM WORKSHOP SDS PAGE

LAPORAN PRAKTIKUM WORKSHOP

S2 FASTTRACK BIOMEDIK

SODIUM DODECYL SULFATE POLYACRYLAMIDE GEL ELECTROPHORESIS

(SDS – PAGE)

PENDAHULUAN

            Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan yang memisahkan analit berdasarkan kemampuannya bergerak dalam medium konduksi yang biasanya berupa larutan buffer dan akan memberikan respons setelah diberikan medan listrik (Harvey, 2000). Jika suatu zat bermuatan diberi potensial, maka zat tersebut akan berpindah sepanjang medium yang kontinu ke arah katode atau anode sesuai dengan muatan yang dibawanya.

            Elektroforesis SDS – PAGE termasuk ke dalam kelompok elektroforesis zona/ wilayah, yaitu kelompok elektroforesis yang dibedakan berdasarkan medium penyangganya. Elektroforesis SDS – PAGE menggunakan gel buatan sebagai medium penyangga. Gel yang digunakan terbentuk dari polimerisasi akliramida dengan N,N’ – metilena bis akrilamida sehingga terbentuk ikatan silang karena polimerisasi akrilamida sendiri hanya menghasilkan ikatan linear yang tidak membentuk gel kaku (Girindra, 1993).

            Polimerisasi dapat terjadi dengan cepat pada suhu kamar dengan adanya katalis dan inisiator. Katalis dan inisiator yang umum digunakan adalah N,N’,N’,N’ – tetrametildiamina (TEMED) dan ammonium perosulfat (APS) sebagai sumber radikal bebas yang akan menginisiasi pembentukan polimer (Caprette, 2005). Pada metode ini, digunakan natrium dodecyl sulfat (SDS) dan β – merkaptoetanol. SDS merupakan deterjen anionik yang bersama dengan dengan β – merkaptoetanol dan pemanasan menyebabkan rusaknya struktur 3 dimensi protein menjadi konfigurasi acak. Hal ini disebabkan oleh pecahnya ikatan disulfida yang selanjutnya tereduksi menjadi gugus – gugus sulfidril.

            Pergerakan partikel di dalam medium bergantung pada ukuran partikel dan ukuran medium penunjang. Ukuran pori dari gel ditentukan oleh konsentrasi gel poliakrilamida. Protein yang besar mempunyai mobilitas yang lebih lambat dibandingkan dengan kompleks protein yang lebih kecil. Bobot molekul protein dapat ditentukan dengan kalibrasi menggunakan standar protein yang sudah diketahui bobot molekulnya (Rybicki et al. 1996). Teknik elektroforesis gel banyk digunakan baik di bidang kimia maupun biokimia, karena teknik ini memiliki banyak keuntungan, di antaranya ialah memiliki daya resolusi tinggi, sederhana, dan mudah dibawa (Girindra, 1993).

Protein – protein dapat dipisahkan berdasarkan berat molekul. SDS – PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrilamide Gel Electrophoresis) adalah teknik elektroforesis yang sering digunakan dalam analisis protein di laboratorium. Sampel protein didenaturasi (dipanaskan) dan dicampur dengan SDS (yang merupakan deterjen yang anionik) dengan akibat kompleks protein – deterjen bermuatan negatif dan protein yang lebih besar mempunyai muatan negatif yang lebih besar. Kompleks protein – deterjen itu akan dibawa oleh medan listrik ke arah kutub positif (anoda). Gel akrilamide berfungsi sebagai dasar atau alas dari atas gerakan sampel protein. Konsentrasi akrilamide menentukan ukuran pori – pori gel dan ukuran pori – pori gel menentukan jarak yang ditempuh oleh kompleks protein – SDS. Jadi beberapa faktor yang dapat ditentukan untuk memaksimalkan pemisahan protein – protein melalui teknik SDS – PAGE, antara lain: kadar SDS, konsentrasi gel akrilamide dan ukuran gel nya, kemurnian sampel protein dan jumlah sampel yang diletakkan pada gel, voltage yang digunakan pada alat elektroforesis dan selama medan listrik dihidupkan.

            Gel disusun oleh akrilamida dan N’,N’ – metilen – bis – akrilamida yang berpolimerisasi melalui mekanisme radikal bebas dengan bantuan katalisator N,N,N’,N’, - tetrametilen diamina (TEMED) dan inisiator ammonium perosulfat (APS). Prinsip analisis SDS – PAGE yaitu pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul (Dunn, 1989).

TUJUAN

1.    Melakukan prosedur elektroforesis vertikal dengan metode SDS – PAGE.

2.    Mengidentifikasi berat molekul dari suatu sampel protein.

METODE

1.    Alat dan Bahan

Persiapan Gel

Alat

·           Gel caster

·           Kaca

·           Penjepit kaca

Bahan

·                Separating gel 12,5%, yang mengandung (per slap) :

-        Acrylamide 30%                 2063   µl

-        1,5 M Tris-HCl pH 8,8        1250     µl

-        H2O                                    1635   µl

-        SDS 10%                            50        µl

-        APS 10%                            50        µl

-        TEMED                              10        µl

·                Stacking gel, yang mengandung (per slap) :

-        Acrylamide 30%                 257,5   µl

-        1 M Tris-HCl pH 6,8           312,5   µl

-        H2O                                     662,5   µl

-        SDS 10%                            12,5     µl

-        APS 10%                            3,75     µl

-        TEMED                               2,5       µl

* acrylamide 30% (50 ml):

-        Acrylamide                         14,5   gr

-        Bis Acrylamide                   0,25 gr

-        H2O                                     50      cc

* 1,5 M Tris-HCl pH 8,8 (50 ml):

-        Tris HCl                              11,823 gr

-        Aquades                             50        cc

* 1 M Tris-HCl pH 6,8 (20 ml):

-        Tris-HCl                              3,1528 gr

-        Aquades                             20        cc

*SDS 10% (10 ml):

-        SDS                                    1          gr

-        Aquades                             10        cc

*APS 10% (1ml) :

-        APS                                     0,1       gr

Persiapan Sampel

Alat

·           Appendorf 1,5 ml

Bahan

·           Sampel protein

·           Tracking dye / RSB :

-        Tris HCl pH 6,8                   1          ml

-        Gliserol                               0,8       ml

-        SDS 10%                            1,6       ml

-        β mercaptoetanol               0,4       ml

-        bromophenol blue 1%        0,2       ml

-        Aquades                             4          ml

Elektroforesis Gel

Alat

·           Alat elektroforesis yang memberikan tegangan listrik ± 120V

Bahan

·           Running Buffer (1000 ml) :

-        Glicyne                                  14,2     gr

-        Tris Base                              3,03   gr

-        Aquades steril                     1000    ml

-        SDS                                      1        gr

Staining dengan Coomasie Briliant Blue

Alat

·           1 buah wadah plastik bertutup ukuran 10x10x10 cm

Bahan

·           Staining Solution (100 ml) :

-        Coomassie Briliant Blue R250       0,1       gr

-        Methanol                                           40        cc

-        As. Ac. Glacial                                 10        cc       

-        Aquades                                           100      cc

Destaining

Alat

-        1 buah wadah plastic bertutup ukuran 10x10x10 cm

Bahan

-        Destaining Solution (100 ml) :

-        Methanol                                         20        cc

-        As. Ac. Glacial                               10        cc

-        Aquades                                         100      cc

2.    Prosedur

Persiapan Gel

1.         Alat dan bahan pembuatan gel disiapkan. Kaca dipasang pada penjepitnya.

2.  Campuran bahan separating gel disiapkan sesuai dengan resep dan konsentrasinya.

3.    Campuran separating gel dihomogenkan dengan cepat agar tidak segera mengeras.

4.         Campuran separating gel dimasukkan pada gel caster dengan bantuan pipet, diikuti dengan pemberian aquades agar permukaan gel rata dan oksigen tidak ada.

5.         Ruang disisakan untuk stacking gel.

6.         Setelah separating gel mengeras, sisa aquades dibuang.

7.         Campuran stacking gel disiapkan.

8.         Campuran stacking gel dihomogenkan dengan cepat.

9.         Campuran stacking gel dituang di atas separating gel dan sisir (comb) segera dipasang diatas stacking gel.

10.      Gel dibiarkan hingga mengeras.

11.      Setelah gel mengeras, kaca dilepas dari penjepitnya.

12.      Gel pada kaca dipasang pada alat elektroforesis dan running buffer dituang.

Persiapan Sampel

Prosedur

1.         Sampel protein dan tracking dye (RSB) disiapkan.

2.     20 µl sampel protein dan 20 µl tracking dye (RSB) dicampur, dimasukkan dalam eppendorf.

3.         Sampel direbus pada suhu 100°C selama 5 menit.

4.         Sampel didinginkan pada suhu ruangan.

Elektroforesis Gel

Prosedur

1.         Sampel protein dimasukkan ke dalam gel melalui ujung atas stacking gel sebanyak 2 µl / sumur.

2.         Power supply dinyalakan.

3.         Sampel diproses atau running dengan memberikan tegangan listrik sebesar 120 V selama 60-90 menit.

4.         Gel dilepas dari kacanya.

Staining dengan Coomasie Briliant Blue

Prosedur

1.         Gel direndam dalam staining solution Coomasie Brilliant Blue R - 250.

2.    Rendaman gel dalam staining solution Coomasie Brilliant Blue R – 250 diletakkan di dalam shaker selama 20 - 30 menit.

Destaining

Prosedur

1.    Pewarna pada gel dihilangkan dalam rendaman destain solution ± 1 – 2 jam sambil tetap di shaker.

2.    Lakukan destaining semalam di atas shaker sampai gel kelihatan bersih.

3.    Gel siap discan dan dianalisa hasilnya.

4.    Hitung BM protein pada band protein yang tampak pada gel menggunakan grafik regresi linear.

HASIL

            Prosedur pelaksanaan elektroforesis vertikal dengan metode SDS – PAGE

  

HASIL SCAN GEL

            Setelah gel distaining dan discan, didapatkan band – band protein yang terbentuk pada tiap sumuran.

 

Sampel yang dimasukkan dalam tiap sumuran gel adalah sebagai berikut:

Sumuran	Sampel
M	Marker
1	Pili H. pylori
2	Pili Shigella
3	OMP Shigella
4	POT1 Typhi
5	POT2 Salmonella
6	OMP S. typhi
7	Protein Enterocyte

Perhitungan berat molekul (BM) dari masing – masing protein didasarkan pada marker yang tersedia. Perhitungan dilakukan dengan mengukur total jarak tracking dari stacking gel ke separating gel, dilanjutkan dengan mengukur jarak tracking dari stacking gel ke masing – masing band protein yang terbentuk, kemudian dari BM masing – masing band marker di log kan, kemudian dicari retardation factor (RF) dengan membagi jarak tracking masing – masing band dengan jarak tracking total. Setelah itu dibuat kurva marker log BM sebagai axis (x) dan RF sebagai ordinat (y).

Berikut adalah tabel perhitungan berat molekul pada marker:

BAND	BM MARKER (kDa)	JARAK TRACKING (mm)	LOG BM	RF
1	260	2	2.414973348	0.029412
2	135	6.5	2.130333768	0.095588
3	95	8	1.977723605	0.117647
4	72	10.5	1.857332496	0.154412
5	52	17	1.716003344	0.25
6	42	21.5	1.62324929	0.316176
7	34	26	1.531478917	0.382353

Keterangan:

-       BM Marker didapat dari BM standar marker

-       Jarak tracking total  didapat dari pengukuran dari stacking gel ke separating gel, didapatkan jarak tracking total sebesar 68 mm

-       Jarak tracking didapatkan dari pengukuran dari stacking gel ke tiap band yang tampak pada gel.

-       Log BM merupakan Log dari BM

-       RF merupakan hasil pembagian antara jarak tracking dengan jarak tracking total.

Setelah itu dibuat kurva regresi linear sebagai berikut:

Dengan sumbu (x) adalah Log BM dan sumbu (y) adalah RF, dan didapatkan persamaan sebagai berikut:
y = -0.438x + 1.030
R² = 0.917, di mana R yang baik adalah R yang lebih dari 0,98

Kemudian persamaan tersebut digunakan untuk mengukur berat protein sampel dengan perhitungan sebagai berikut:

Log BM = (RF – 1,365)/ -0,593

BM = 10^{(Log BM)}

            Pada praktikum hanya dilakukan perhitungan berat molekul pada sumuran 2 (sampel pilli H. pylori):

BAND	BM MARKER (kDa)	JARAK TRACKING (mm)	LOG BM	RF
1	164.9293237	4	2.217297878	0.058824
2	99.78376762	10.5	1.999059898	0.154412
3	82.24740669	13	1.915122213	0.191176
4	67.79294938	15.5	1.831184529	0.227941
5	51.72157842	19	1.71367177	0.279412
6	22.09764323	30	1.344345958	0.441176

            Sehingga pembacaan band pada sumuran sampel adalah sebagai berikut:

 

PEMBAHASAN

            Pada elektroforesis vertical ini digunakan metode SDS PAGE dengan gel berbahan dasar polikrilamida karena sampel yang digunakan adalah sampel protein. Pemilihan komposisi stacking gel dan separating gel didasarkan pada berat molekul protein yang akan di – running, bila sampel protein yang akan di running belum diketahui berat molekulnya, maka digunakan gel dengan komposisi 12,5% terlebih dahulu, jika kemudian saat running terjadi loss protein, maka komposisi gel dinaikkan menjadi 25% dan seterusnya.

            Komposisi gel berpengaruh terhadap hasil running sampel protein. Gel berperan sebagai pori atau saringan yang akan menyaring protein berdasarkan ukuran molekul. Protein dengan berat molekul kecil akan turun terlebih dahulu dengan cepat menuju ke dasar gel dan protein dengan berat molekul besar akan tertahan di gel bagian atas. Jika komposisi gel yang digunakan tidak sesuai, jika komposisi gel terlalu kecil maka pori dari gel menjadi longgar sehingga protein dengan berat molekul kecil akan terus turun, sedangkan jika komposisi gel terlalu besar maka pori dari gel menjadi rapat sehingg protein dengan berat molekul besar akan tertahan di atas.

            Penggunaan RSB sebagai tracking dye berfungsi untuk menandai protein yang tersangkut di pori gel sebagai band. Pemanasan protein dilakukan sebelum pemberian RSB dengan tujuan untuk melepaskan ikatan protein yang rumit menjadi sebuah ikatan sederhana yang akan lebih mudah untuk dilakukan proses running elektroforesis. Pemanasan dilakukan selama 5 menit di air mendidih dan tidak lebih dari 7 menit karena akan menyebabkan denaturasi protein.

            Aliran listrik yang digunakan sebesar 90 – 120 V berfungsi untuk memberi muatan pada protein untuk bergerak melewati pori gel dan bergerak dari atas ke bawah gel sesuai dengan berat molekul sampel protein tersebut. Protein dengan berat molekul kecil akan bergerak terlebih dahulu dengan cepat melewati pori sampai batas di mana pori tidak cukup besar untuk melewati pori gel. Batas tersebut lah yang terlihat sebagai band pada gel. Aliran muatan listrik mengalir ke protein lewat running buffer yang diisikan pada kit elektroforesis yang berisi gel yang di running. Setelah itu dilakukan staining dengan menggunakan Coomasie Brilliant Blue dalam waterbath agar band yang timbul tampak jelas. Setelah itu dilakukan destaining agar band dapat diamati.

            Berat molekul protein diidentifikasi dengan menentukan kurva baku dari marker protein dengan menggunakan Log dari berat molekul dan RF (hasil bagi tracking band dan tracking total). Setelah diketahui persamaan dari kurva baku, maka persamaan tersebut dapat digunakan untuk menghitung berat molekul dari sampel protein yang kita running.