CATATAN KULIAH PRAKTIKUM DNA

Types of DNA:
Genomic (chromosomal)
Organella (satellite)
Plasmid (extr chromosomal)
Phage/ viral (DS atau SS)
Complementary (mRNA)


Spot: kurang dari 200 ml
Kit Qiagen: lebih sensitif
Beberapa Kit tidak ada proteinase K


Sensitivitas kit lebih rendah --> minimal penggunaan darah 300 mikroliter


Mekanisme:
Merusak membran nukleus




Ekstraksi:
1. Isolasi DNA dari sampel
2. Eliminasi dari debris seluler.
3. Elusi dari DNA yang dimurnikan.


Melepas protein histon: menggunakan…..


Mengukur kemurnian: menggunakan spektrofotometri 1 ml - 2 ml --> tidak bisa karena …
Menggunakan spektrofotometer dengan


General steps:
Step 1: denaturing cell lysis (SDS, alkali, boiling, chaotropic--> melepas ikatan polimer).
Step 2: enzyme treatments
Protease: inaktivasi protein dan inktivasi nuklease --> mengaktivasi DNAse dalm sampel --> karena DNAse menghancurkan DNA yang ada.
RNAse --> DNAse free --> menghilangkan RNA
DNAse --> RNAse free
Step 3: ethanol presipitasi --> ethanol dingin --> kelihatan benang DNA (putih) --> bisa melihat kemurnian, namun mungkin masih bercampur dengan protein --> untuk mengendapkn DNA.




Type of methods:
Differential


Adsoprtion methods (standar yang dipakai sekarang).


Prinsip dari ekstraksi  I:
4. Cell disruption or cell lysis by sonicating, grinding, lysis buffer (Tris HCl, trition X - 100), removal of mebrane lipis by detergents.
5. Tambhkan chelating agents to sequester divalent cations such s Mg2+ and Ca2 to prevents enzymes like DNAse from degrading the DNA.
6. Inkativasi dari nuklease dengan protease K (1 jam atau overnight).. Cellular and histone proteins bound to DNA --> removing


Prinsip ekstrksi II:
Guanidin tiosianat: bagus untuk isolasi DNA tapi karsinogenik --> bisa memisahkn DNA dan protein --> memecah ikatan polimer --> DNA dalam fase (atas) --> fase bawah (protein).
Nucleic acid (DNA, RNA) --> solved in aquaeous phase.
DNA atau RNA kemudian dipresipitasi dengan 2 - propanolol dan etanol.


Prinsip dari ekstraksi 3: spin column based nucleic acid purification (standard method) --> menggunakan silic
DNA melekat pd silica dalam PH tertentu dan buffer asam tertentu.


Ikatan DNA tercampur dengan … --> dicuci dengan bahan tertentu: asam tinggi pH tertentu, nantinya DNA akan tersarinf pada silica..
Pada qiagen menggunkan guanidine.


Kolom dicuci dengan KPO4 pH 8 --> bersifat garam turun --> DNA akan lepas, ikatan turun..


Tahap terakhir --> elution buffer --> jangan dibuang -->


Prinsip chotropic salts --> … DNA mudah berikatan dengan ..


Elusi dengan low salt solution --> allows renaturing of RNA..




Prinsip:
Melisisikan, menghancurkan membran sel..
Proteinase K - destroys ..


Cell soup is added to a spin column,
Filter in the column attracts DNA.


DNA yng terjebak dalam membran silica terjebak --> …


Kesalahan yang sering terjadi:
1. Tidak melabel tube.
2. Proses jangan terlalu lama.
3. Tidak atau lupa mengganti pipet dan macerators.


Pada praktikum DNA yang diisolasi dalam praktikum ini: DNA manusia dan parasit (plasmodium).


Evaluasi asam nukleat:


Spektrofotometer : quantity, quality
Menggunakan panjang gelombang tertentu: 250 - 280 nm
DNA: dites dulu kuantitas dan kualitasnya.